Hoe maak je een Gram-kleuring

Gramkleuring is een snelle procedure die wordt gebruikt om te zoeken naar de aanwezigheid van bacteriën in weefselmonsters en deze te karakteriseren als grampositief of gramnegatief op basis van de chemische en fysische eigenschappen van hun celwanden. Gram-kleuring moet bijna altijd worden uitgevoerd als de eerste stap in het diagnosticeren van een bacteriële infectie

De Gram-kleuring is vernoemd naar de Deense wetenschapper Hans Christian Gram (1853 - 1938), die de techniek in 1882 ontwikkelde en deze in 1884 publiceerde als een techniek om twee soorten bacteriën met vergelijkbare klinische symptomen te onderscheiden: bacteriën Streptococcus pneumoniae (ook bekend als pneumococcus) en Klebsiella pneumoniae.

stappen

2

Steriliseer een glasplaatje voor een microscoop. Als de schuif vuil is, was hem dan met een sopje om vet en vuil te verwijderen. Desinfecteer het met ethanol, glasreiniger of de door uw laboratorium aanbevolen methode.

3

Plaats het monster op de dia. U kunt de Gram-kleurmethode gebruiken om bacteriën te identificeren die aanwezig zijn in medische monsters of in bacteriële culturen in een petrischaal. Als Gram-kleuring nuttig is, plaatst u een laag dun van het monster op de dia. Een monster dat jonger is dan 24 uur oud wordt aanbevolen, omdat oudere bacteriën mogelijk beschadigde celwanden hebben die minder voorspelbaar reageren op Gram-kleuring.

4

Bevestig het monster op warmte. De warmte zal de bacteriën op de glijbaan fixeren, zodat ze tijdens het kleuren niet zo gemakkelijk worden afgespoeld. Schuif de dia twee of drie keer snel door de vlam van een bunsenbrander of verwarm deze op een elektrische glijverwarming. Niet oververhitten of de monsters kunnen worden vervormd. Als je een bunsenbrander gaat gebruiken, moet de vlam een ​​kleine, blauwe kegel zijn, geen lange, oranje.

5

Plaats de dia in een kleurbak. Een bakje voor vlekken is een ondiepe bak van metaal, glas of plastic met een kleine gaas- of draadhouder langs de bovenkant. Plaats de schuif op deze standaard zodat de vloeistoffen die u gaat gebruiken, in de lade kunnen worden afgetapt.

2

Spoel het violette glas voorzichtig af. Kantel de dia en gebruik een wasfles om een ​​kleine stroom gedistilleerd water te sproeien of tik op de bovenkant van de dia. Het water moet op het oppervlak van de vlek druppelen, maar er niet direct op worden gericht. Spoel niet te veel, waardoor vlekken kunnen worden verwijderd bacterie Gram positief.

3

Week de vlek met jodium en spoel daarna uit. Gebruik een pipet om de vlek met jodium te bedekken. Laat staan ​​voor ten minste 60 seconden, spoel dan grondig met dezelfde methode. Jodium in de vorm van negatief geladen ionen samenwerkt met CV + ionen grote samengestelde kristalviolet en jood (verbinding CV-I) in de binnenste en buitenste lagen van de cel vormen. Dit houdt de kleur van het violette kristal in de cel vast, op de plaats waar het gekleurd is.

4

Voeg een bleekmiddel toe en spoel daarna snel. Voor deze kritische stap wordt normaliter een mengsel van aceton en ethanol in een verhouding van 1: 1 gebruikt. De voltooiing van deze stap moet zorgvuldig worden berekend. Houd de dia schuin en voeg de ontkleuringsoplossing toe totdat er geen paarse kleur zichtbaar is in de afvoer. Dit duurt meestal minder dan 10 seconden of zelfs minder als het bleekmiddel een hoge concentratie aceton bevat. Stop onmiddellijk of de ontkleurer verwijdert de violetkristalkleuring van zowel Gram-positieve als Gram-negatieve cellen en de kleuring moet worden herhaald. Spoel onmiddellijk het overtollige ontkleurende middel af met behulp van de bovengenoemde techniek.

5

Week de vlek met een secundaire vlek en spoel hem daarna af. Een secundaire kleurstof, meestal safranine of fuchsine, wordt gebruikt om extra contrast toe te voegen tussen Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën, waarbij verkleurde (Gram-negatieve) bacteriën van roze of rood worden gekleurd. Laat de kleurstof in het monster gedurende ten minste 45 seconden, dan spoelen.

6

Droog de dia. U kunt de dia met lucht laten drogen of drogen met absorberend papier dat voor dit doel wordt verkocht. De gramkleuring is voltooid.

2

Identificeer Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën. Bestudeer de dia onder de lichtmicroscoop. Grampositieve bacteriën zien er violet uit vanwege het violette kristal dat is opgesloten in hun dikke celwanden. De Gram-negatieve bacteriën zien er roze of rood uit, omdat het violet door de dunne celwanden is gespoeld en vervolgens de roze secundaire kleurstof is toegevoegd.

3

Zoeken naar referentiebeelden. Als u niet zeker weet wat een bacterie is, zoek dan naar verzamelingen referentiebeelden die zijn ingedeeld naar de vorm en het resultaat van de Gram-kleuring. U kunt databases online vinden in de Nationale database van microbiële ziekteverwekkers uit de VS, Bacteriën op foto`s en veel andere sites. Om de identificatie verder te vergemakkelijken, worden algemene of belangrijke voorbeelden voor diagnose hieronder ingedeeld naar de Gram-status en -vorm.

4

Identificeert Gram-positieve bacteriën door hun vorm. Bacteriën worden verder ingedeeld naar hun vorm onder de microscoop, meestal als coccos (bolvormig) of staven (cilindrisch). Dit zijn enkele veelvoorkomende Gram-positieve bacteriën (gekleurd violet) ingedeeld naar vorm:

5

Identificeer Gram-negatieve bacteriën Gram-negatieve bacteriën (gekleurd roze) worden vaak ingedeeld in drie groepen. De kokosnoten zijn de bolvormige bacteriën, de staafjes zijn de lange, dunne bacteriën en de coccoïdestaven bevinden zich op een tussenliggend punt.

6

Evalueer de gemengde resultaten. Sommige bacteriën zijn moeilijk te kleuren precies vanwege de broosheid van hun celwanden of hoe wasachtig ze zijn. Ze kunnen een mengsel van een violette of roze vlek in dezelfde cel of tussen verschillende cellen in hetzelfde monster hebben. Elk monster bacteriën dat ouder is dan 24 uur kan dit probleem hebben, maar sommige soorten zijn moeilijk te beitsen op elke leeftijd. Ze kunnen meer gespecialiseerde tests vereisen om het aantal identificatiemogelijkheden te verkleinen, zoals Ziehl-Neelsen-kleuring, observatie van gewasgroei, TSI-agar of genetische tests.

7

Gooi de materialen weg. De procedures voor afvalverwijdering variëren tussen laboratoria en volgens de gebruikte materialen. Normaal gesproken wordt de vloeistof in de kleuringslade weggegooid als gevaarlijk afval in gesloten flessen. Doop de dia`s in een oplossing met 10% bleekwater en gooi ze weg in naaldencontainers.